Terapia con celulas madre en Odontología

* Dra. Liliana Otero M.
Odontóloga,
Pontificia Universidad Javeriana.Colombia.
Articulo de Revisión

La gran cantidad de información derivada de los recientes avances en el proyecto genoma humano cambiará totalmente el ejercicio de la odontología dentro de los próximos 20 años. En el año 1.990 se inició el proyecto genoma humano financiado en Estados Unidos por el instituto nacional de salud y el departamento de energía, y  en Inglaterra por la Universidad de Cambridge. Como director del proyecto fue nombrado el Dr. James Watson. Sin embargo desde el comienzo este proyecto contó con la colaboración de otros países como Francia, Alemania, Japón, China y Canadá[i]. Los primeros 5 años del proyecto fueron dedicados al desarrollo de mapas físicos y genéticos del hombre y de  los organismos modelo más simples  (bacteria,  levadura y drosophila melanogaster)[ii]

La disponibilidad en los mapas físicos y genéticos aceleró considerablemente  la identificación de genes involucrados en desórdenes producidos por un gen único. Mientras que hasta 1.990 sólo se habían identificado 10 de estos genes, en el año 1.997 el número creció a más de 100 genes identificados[iii]. En 1.996 una compañía privada: Celera Genomics Inc. se comprometió a secuenciar el genoma humano con fines comerciales. En el año 2.000 ambas entidades, la pública y la privada, anunciaron el primer borrador de la secuencia del genoma humano[iv].

Debido a que cada una de las enfermedades que padece el hombre tiene una base genética (con excepción del trauma), las implicaciones de este proyecto son tan profundas que han   dividido la historia de la medicina en dos: “antes y después del proyecto genoma humano”. El genoma humano describe el lenguaje del código genético en el cual están escritas las instrucciones del DNA. Estas  instrucciones son la esencia de  la construcción de todos los organismos vivos. En el hombre, genoma compromete aproximadamente 35.000 genes, de los cuales la mayoría permanece sin ser identificado[v]. Además de finalizar el análisis de secuenciación completa, este proyecto necesita también secuenciar los genomas de otros organismos con el fin de compararlos con los del genoma humano, ya que una de las herramientas más poderosas para la identificación de los exones codificantes y de las regiones reguladoras  es precisamente este parámetro de comparación. Esta es la razón por la cual  tanto el sector público, como el sector privado han comenzado a secuenciar los genomas completos del cerdo, el perro y el chimpancé[vi].

El DNA de todos los individuos humanos es idéntico en el 99.9%. Se espera que el 0.1% restante de variación pueda proveer mucha información acerca del riesgo de contraer enfermedades. Diferentes grupos del sector público y privado tienen la tarea de desarrollar este catálogo de variantes y de identificar más de dos millones de éstas, que son denominadas: “polimorfismos  de nucleótido singular” o SNP por su sigla en inglés. Por otra parte las variantes comunes que repercuten en las funciones del gen tiene un  interés particular ya que están involucradas en la etiopatogenia de las enfermedades poligénicas[vii]. Por ejemplo la diabetes mellitus es una enfermedad que involucra al parecer, entre 5  y 10 genes, cada uno de los cuales posee variantes que interactúan entre sí y con el medio, aumentando la complejidad en la etiología de la enfermedad. En los próximos cinco años la tecnología permitirá determinar los genes asociados con esta enfermedad y un posible plan de prevención o de  tratamiento oportuno.

La tecnología desarrollada actualmente para el estudio de la expresión génica permite el análisis de transcripción de muchos más de 10.000 genes por experimento, lo cual permite encontrar  las diferencias que ocurren en diferentes tipos de tejido y además explorar el patrón de expresión de una enfermedad. Estos análisis han probado ser eficaces en la identificación de ciertas malignidades que no pudieron ser identificadas anteriormente  por otros criterios diagnósticos.

Las estrategias utilizadas para hacer el análisis a gran escala del DNA y del RNA también son aplicables a proteínas para  caracterizar su estructura, cantidad y localización dentro de la célula así como también las modificaciones postranslacionales  y los patrones de interacción. Por esta razón ya se viene realizando el proyecto “proteoma Humano” que intenta describir todas las funciones e interacciones de las proteínas dentro del organismo. Las proteínas activan numerosas enzimas que provocan las reacciones químicas que tienen lugar en los organismos vivos.  La realización de este proyecto es de mayor complejidad que la del proyecto genoma humano, pero las implicaciones clínicas son espectaculares en el campo de la medicina y de las ciencias afines a ésta.  La biólogo Paula Grabowsky, de la universidad de Pittsburg, en Pensilvania, sostiene que un solo gen de la mosca  es capaz de producir 98.000 diferentes proteínas. Este hecho permitiría que existan, al menos, 300.000 proteínas actuando en el organismo humano, dirigidas por los cerca de 35.000 genes que se han podido contabilizar en la secuencia genética.

Todos los avances que ha generado el proyecto genoma humano tienen implicaciones éticas, legales y sociales; por esta razón desde el inicio del proyecto se destinó el 5% de los recursos para el programa “ELSI” que se encarga de estudiar las implicaciones culturales, filosóficas, sociales, éticas y legales de la información derivada con esta investigación[viii]. Al lado de los cambios  drásticos que ha generado este proyecto en medicina y afines, otras ciencias como el derecho, la bioinformática y la bioingeniería tendrán paralelamente un gran desarrollo y un rumbo diferente en este siglo.El propósito de esta serie de artículos es plantear la forma por la cual, la terapia génica, la terapia con células madre mesenquimatosas (Stem cell), la ingeniería biomédica la farmacogenómica, la imagenología y la robótica podrían cambiar radicalmente el ejercicio de  la odontología y de la ortodoncia en el presente siglo.

TERAPIA CON STEM CELLS EN  ODONTOLOGÍA.

LA FUNCIÓN  DE LAS STEM CELLS.

Las Stem Cells (SC) o células madre son células extraordinarias que poseen la capacidad de autoregeneración y pueden dar origen a diferentes tipos celulares, este tipo de células pueden hallarse en el embrión o en tejidos adultos[ix].

Durante la embriogénesis humana normal, las células madre del huevo fertilizado se diferencian en una amplia variedad de tipos de células que forman los órganos adultos[x]. También el cuerpo humano tiene una notable capacidad para regenerarse, las células de tejidos como sangre, intestino delgado y epitelios se dividen rápidamente y se regeneran continuamente a lo largo de la vida gracias a la diferenciación de las células madre o SC. Estas células hacen posible la regeneración de células dañadas o que empiezan a envejecer durante toda la vida.

Los médicos han explorado las SC para propósitos terapéuticos durante más de 40 años.  Por ejemplo, el transplante de SC hematopoyéticas (transplante de médula ósea) es un “salvavidas” para los pacientes con ciertos tipos de enfermedades de la médula ósea.

UN CAMBIO EN LA PERSPECTIVA DE LAS STEM CELLS. 

La utilidad del transplante de las SC estuvo limitado porque se pensaba que muchos órganos (cerebro, médula espinal, corazón, riñones) carecían de estas células, también se creyó que las células de estos órganos no podían ser reprogramadas para diferenciarse en lineamientos celulares diferenciados durante la edad adulta.

Tres descubrimientos recientes han revolucionado la ciencia y han demostrado el potencial clínico de estas células en un amplio rango de enfermedades humanas.  Primero, las SC han sido detectadas en órganos, como el cerebro[xi], corazón[xii] y músculos[xiii], que previamente se pensaba que carecían de éstas y por tanto, de potencial regenerativo.  Por ejemplo, varias áreas del cerebro contienen SC que mantienen la capacidad de proliferar y madurar dentro de tipos de células neurales diferentes in vitro e in vivo. Los estudios animales han sugerido que las células proliferantes en el sistema nervioso central juegan un papel importante en el aprendizaje y la memoria. 

Además, estas células pueden ser cultivadas y transplantadas al sistema nervoso central donde ellas se diferencian en neuronas maduras.

De modo similar, las SC  de los músculos esqueléticos (mioblastos) pueden ser cultivadas in vitro y transplantadas dentro del músculo receptor en donde se diferencian en miotubulos y se funden con las fibras musculares endógenas para repoblar el músculo dañado.

Segundo, las SC adultas de órganos específicos parecen mostrar mucha mayor plasticidad de lo que se pensó originalmente y ofrece una alternativa a las SC embrionarias que presentan gran cantidad de consideraciones éticas. Las SC aisladas de un tejido pueden diferenciarse en una variedad de tipos de células y tejidos no relacionados.  Por ejemplo, los experimentos recientes en animales han demostrado que SC neurales pueden diferenciarse en linajes hematopoyéticos.  De modo similar, las SC derivadas de la médula ósea pueden diferenciarse en varios tipos de células no hematopoyéticas, incluyendo las del músculo esquelético, microglía y astroglìa en el cerebro, y hepatocitos[xiv].  Estos hallazgos provocan la asombrosa posibilidad de usar transplantes de médula ósea para tratar una amplia variedad de desordenes, tales como distrofias musculares, enfermedad de Parkinson, apoplejía y falla hepática[xv].

Quizá la demostración más notable de la plasticidad celular ha venido de los experimentos de clonación animal.  El 27 de Febrero de 1997 (Nature) los investigadores en Inglaterra reportaron la clonación de una oveja (la ahora famosa Dolly) por transferencia del núcleo de una célula de la glándula mamaria dentro de un oocito. Ratones, vacas y monos han sido clonados subsecuentemente usando técnicas similares. Estos experimentos demostraron que los núcleos de las células totalmente diferenciadas pueden ser reprogramadas para que se comporten como totipotenciales. De acuerdo a lo anterior, puede ser posible generar tipos específicos de SC terapéuticas in vitro comenzando con un pequeño número de células diferenciadas del paciente a ser tratado (por ejemplo, un espécimen de biopsia de músculo o de piel), evitando así las respuestas inmunes a las células transplantadas.

Tercero, las SC embrionarias (SCE) humanas pueden ser aisladas a partir de fetos en estadíos tempranos (etapa de blastocito, fase celular interna) y se pueden diferenciar in vitro en una amplia variedad de tipos de células. 

Bajo las condiciones de cultivo apropiadas (ambiente propicio), las SCE tienen la capacidad de replicación ilimitada, cuando son reimplantadas dentro de un blastocito, éstas pueden contribuir en la formación de los futuros tejidos, como lo hacen normalmente.

Las SCE pueden diferenciarse en una amplia variedad de tipos de células in vitro, incluyendo células hematopoyéticas, miocitos cardíacos y esqueléticos y adipositos.

Las SCE pueden tener un importante potencial terapéutico, por ejemplo, en un modelo de rata con un desorden desmielinizante humano hereditarios (enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher), se transplantaron SCE diferenciadas en oligodendrocitos y astrositos que generaron mielina en varias áreas del cerebro.

Todos estos hallazgos con las SCE abren una nueva perspectiva para el tratamiento de una variedad de enfermedades que requiere reparación o reconstitución tisular, tales como la apoplejía, enfermedades neuro degenerativas, infarto del miocardio y falla hepática.

En resumen, el descubrimiento de las SC en tejidos adultos, la inesperada plasticidad de las SC adultas y las células diferenciadas, y el aislamiento de las células SCE humanas han expandido la utilidad terapéutica potencial de las terapias con base celular.

La terapia con SC, está atravesando su etapa inicial, las investigaciones en esta área están enfocadas a conocer mejor la forma de aislar y cultivar SC humanas y a determinar como ocurren exactamente los procesos de diferenciación y desdiferenciación in vitro e in vivo.

OBTENCION DE STEM CELLS

Stem Cells Emrionarias (SC)

El cigoto (óvulo fertilizado) es una célula totipotente, capaz de dar origen a todo el organismo. Durante las primeras divisiones el embrión es una esfera compacta (mórula), en la que todas las células son totipotentes. A los pocos días comienza una primera especialización, de modo que se produce un blastocisto, con una capa superficial que dará origen al trofoblasto, del que deriva la placenta, y una cavidad casi “hueca” (rellena de fluido) en la que está la masa celular interna (m.c.i.).

Las células de esta m.c.i. son pluritotentes, porque aunque por sí solas no pueden dar origen al feto completo (necesitan el trofoblasto), son el origen de todos los tejidos y tipos celulares del adulto.

Aunque las células de la masa celular interna del blastocisto son pluripotentes, no son en sí mismas células madre dentro del embrión, porque no se mantienen indefinidamente como tales in vivo, sino que se diferencian sucesivamente en los diversos tipos celulares durante la fase intrauterina. Lo que ocurre es que cuando se extraen del embrión y se cultivan in vitro bajo ciertas condiciones, se convierten en células “inmortales” dotadas de autorrenovación, pluripotencia y contribución a la línea germinal. Las células madre pueden diferenciarse in vivo e in vitro en una gran diversidad de tipos celulares. In vivo la multipotencia se manifiesta, cuando al incorporar células madre en blastocistos pueden dar origen a cualquier tejido u órgano, In vitro pueden dar origen a  diferentes líneas celulares de las tres capas embrionarias (ecto-, meso- y endodermo) con las señales adecuadas para esta diferenciación.

Las células madre embrionarias de ratón pueden contribuir a la línea germinal de ratones quiméricos. Si se inyecta células madre cultivadas de una raza de ratón en el interior de un embrión normal (blastocisto) de otra raza, estas células madre pueden dar origen a cualquier tipo de tejido del adulto. Los ratones en los que hay tejidos procedentes de dos razas distintas se denominan quimeras, y en algunas quimeras las células reproductivas proceden de las células madres introducidas en el blastocisto, de modo que su constitución genética se puede distinguir de la de las células somáticas.

Si las células madre son manipuladas mediante ingeniería genética, y luego transferidas  a un blastocisto, se obtienen ratones quimeras en los que parte de los tejidos están alterados genéticamente. Si las células madre manipuladas contribuyen a la línea germinal, el rasgo genético modificado en el ratón quimera se transmite a la descendencia, constituyéndose entonces una línea de ratones transgénicos. Los ratones transgénicos, incluidos los denominados K.O. (noquedados genéticamente, es decir, con un gen mutante introducido por recomibinación homóloga) son actualmente una herramienta valiosísima en biología y en diseño de modelos de enfermedades humanas[xvi].

Otro tipo de SC son las células madre germinales que se aíslan de fetos, a partir de la cresta germinal, donde se está produciendo la diferenciación de la línea germinal.

Stem Cells Adultas (SCA)

Desde hace años se conoce en humanos, el potencial de las células madres hematopoyéticas en la médula ósea adulta,  que da origen a toda las líneas de células sanguíneas e inmunes[xvii]. Aunque se conocen desde hace tiempo células madre en tejidos que, como la sangre o la epidermis, presentan gran tasa de proliferación, solo recientemente se han descubierto células madre en órganos que normalmente tienen una baja tasa de renovación, como es el caso del cerebro[xviii]. Todo esto hace pensar que existen SCA en cualquier tejido del cuerpo humano y que éstas, en condiciones propicias, pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula; ejemplo de ello son las investigaciones que han obtenido tejido muscular y del cerebro a partir de SC de médula ósea o, aún mas asombroso, SC del Sistema Nerviosos Central (SNC), que han dado origen a tejidos como músculo, sangre y cardiaco.

Actualmente las fuentes mas usadas para extraer SCA son las células madre mesenquimales (MSC) humanas que están presentes en el estroma de la médula ósea, y constituyen una población totalmente diferente de las células madre hematopoyéticas. Su papel es contribuir a la regeneración de los tejidos mesenquimáticos (hueso, cartílago, músculo, ligamento, tendón, tejido adiposo y estroma). Se han aislado y cultivado MSC humanas, y lo que es mejor, se ha logrado su diferenciación controlada hasta células con rasgos típicos de osteocitos, condrocitos o adipocitos[xix].

POTENCIAL DE APLICACIÓN CLINICA EN EL COMPLEJO OROFACIAL

Las SC aisladas de hueso o de pulpa dental podrán ser usadas para reparar el hueso craneofacial o regenerar tejido dental.

Regeneración de tejido óseo.

Algunas patologías como cáncer,  infecciones, trauma, deformidades esqueléticas se tratan con injertos autógenos o materiales aloplásticos, sin embargo estos injertos tienen algunas limitaciones (lugar donante o rechazo). A la fecha, muchos estudios como los de Mankani en el 2001[xx], han mostrado la efectividad de las SC en reparación ósea en modelos animales en donde  las SC son reproducidas en laboratorio, cargadas y transplantadas localmente al sitio del defecto óseo, para reemplazar huesos largos y del cráneo. 

En un futuro las stem cells, serán capaces de reproducir el tejido óseo del complejo craneofacial para reparar defectos producidos por enfermedades degenerativas, y  podrían ser una alternativa para tratar las deficiencias mandibulares en los pacientes con maloclusión  clase II esquelética debida micrognatismo mandibular.

Uno de los inductores de diferenciación de las SC en osteoblastos es la proteína ósea morfogenética 7 y 2 (BMP7, BMP2). Actualmente estas moléculas están siendo utilizadas en la diferenciación fenotípica de las SC.

Regeneración de dentina.

Otro tejido mineralizado que tiene una gran similitud con el hueso es la dentina. Aunque la dentina no se recambia a través de la vida (como si lo hace el hueso), ésta posee un limitado potencial de reparación postnatal, por ello, fue postulado que esta capacidad es mantenida por un grupo de SC pulpares  (SCP) que tienen el potencial de diferenciarse en odontoblastos. Gronthos y col. (2000) encontraron que cuando las SCP son transplantadas con hidroxiapatita/ fosfato tricalcio en ratones inmunocomprometidos, éstas generan estructuras similares a la dentina con fibras colágenas perpendiculares a la superficie mineralizada, como ocurre normalmente in vivo, con contenido de proteínas de la dentina como la sialoproteina dentinal. En otro estudio realizado por el equipo de Gronthos se estudió la capacidad de las SCP de autorenovación y diferenciación en diferentes líneas  celulares. Las SCP fueron obtenidas de dentina ectópica asociada al tejido pulpar in vivo de ratones las cuales fueron transplantadas en ratones inmunocomprometidos en donde se observó formación de tejido similar a la dentina; algunas colonias que fueron estimuladas apropiadamente, se diferenciaron en tejido adiposo y en células neurales; Estos hallazgos sugieren que las SCP poseen las mismas cualidades de las SC incluyendo autorenovación y diferenciación en diferentes líneas celulares [xxi]. Iohara y col. (2004) [xxii], basados en la teoría que señala que las células del tejido pulpar tienen potencial regenerativo ante un estímulo nocivo, estudiaron  las células pulpares de porcinos in Vitro y al ser estimuladas mediante proteína ósea morfogenética 2 (BMP2). Se confirmó la diferenciación de éstas células  en odontoblastos y se concluyó que  la BMP2 puede inducir diferenciación de las SC progenitoras de pulpa o SCP en odontoblastos lo cual resulta en una formación de dentina.

Regeneración del ligamento periodontal.

Byoung-Moo y col (2004)[xxiii]. basados en la hipótesis que dice que el ligamento periodontal contiene SC que podrían usarse en la regeneración del tejido periodontal, realizaron un estudio en ratones, en donde se aislaron las SC del ligamento periodontal (SCPDL) de 25 dientes humanos, y encontraron que las SCPDL expresan marcadores de SC mesenquimales (STRO-1 y CD146/MUC18 in  Vitro)  , además se observó una diferenciación en células como cementoblastos, adipocitos y células formadoras de colágeno (fibroblastos); in vivo, se observó en ambos grupos de roedores la capacidad de las SCPDL de generar cemento. Estos hallazgos sugieren que el ligamento periodontal contiene células con el portencial de generar cemento y tejido similar al ligamento periodontal in vivo, lo cual abre nuevas posibilidades terapéuticas para la regeneración de tejido destruido por enfermedad periodontal.

Regeneración de dientes:

El desarrollo de los dientes es el resultado de interacciones recíprocas entre el mesénquima y las células epiteliales, en donde el epitelio provee la información necesaria para la iniciación y determinación de la forma. Ohazama y col. (2004)[xxiv], realizaron un estudio en ratones a los cuales se les extrajo SCE (E14.2) SC neurales (E14 de cordón espinal) y SCA (obtenidas de médula ósea de ratones de 6 a 9 semanas de edad), posteriormente estos 3 grupos de SC fueron implantadas en epitelio oral disecado de ratones transgénicos, el epitelio se incubó por 3 días y posteriormente se trasplantó a cápsula renal de otro grupo de ratones transgénicos por 10 días. Los resultados mostraron que  en el grupo de las SCA se formó tejido dental (idéntico) rodeado por tejido óseo y blando, en el grupo de las SCE y neurales se presentó una falla en el explante del tejido (ruptura de las muestras), pero hubo hallazgos histológicos y moleculares compatibles con la  neo-formación de dientes (observación de diferenciación osteoblástica y odontoblástica), por lo tanto se puede concluir que las SCE, SCA o neurales, adecuadamente estimuladas, pueden dar origen a un diente con su tejido óseo circundante.

La inducción que se realiza de las SC para la formación de tejido dental completo es mediante el estímulo de los genes  MSX1, Lhx7 y el Pax9, sumado a factores de crecimiento[xxv].

COMBINACION DE TERAPIAS

La terapia celular y la terapia  génica por sí mismas son prometedoras en el tratamiento de una variedad de enfermedades humanas, pero la combinación de estos enfoques puede ser incluso más útil para ciertos desórdenes.  Por ejemplo, la implantación de SC del músculo esquelético que han sido modificadas genéticamente con vectores que programan la expresión y secreción de las proteínas terapeúticas, tales como la eritropoyetina o la hormona de crecimiento, resulta en la liberación estable de proteínas recombinantes a la circulación sistémica.  De modo similar, la reconstitución genética de las SC hepáticas o miocíticas carentes de productos genéticos específicos con una copia normal del gen defectuoso puede ser útil en el tratamiento de pacientes con mutación genética única heredada, como la hemofilia y la distrofia muscular.

La Ingeniería de tejidos es un área que no se puede desligar de la terapia con  stem cells, ya que muchos de los polímeros usados para promover la formación de un tejido, son embebidos, no solo en factores de crecimiento y nutrientes, sino que son mezclados con stem cells que pueden haber sido previamente diferenciadas en una línea celular  (p.e. osteoblastos). Existen muchos estudios en la actualidad en donde se regeneran tejidos del complejo craneofacial con la ayuda de células madre tales como: defectos mandibulares[xxvi], creación de cóndilos mandibulares[xxvii], formación de pequeños segmentos de hueso creación y transplante de grandes segmentos de hueso mandibular entre otros[xxviii].

CONSIDERACIONES ÉTICAS.

Como muchos de los nuevos enfoques  terapéuticos, las terapias celular y genética provocan un buen número de consideraciones y problemas éticos importantes y difíciles.  Algunos son comunes para cualquier nueva terapia que involucre la experimentación en humanos, mientras que otras son más exclusivas para los métodos genéticos y celulares específicos usados en terapéutica celular y genética.  Estos debates éticos continuarán siendo un determinante importante del progreso y futuro de estas terapias.

Como la terapia con células madre se ha comenzado a emplear en pacientes y dada la incertidumbres de las pruebas clínicas, se debe comunicar a los pacientes este echo y no crear falsas esperanzas. Además, se debe comunicar claramente que estas terapias aún se encuentran en investigación y enterar al paciente de los riesgos, beneficios y efectos adversos.

La Sociedad Americana de Terapia Genética sugirió que los investigadores clínicos involucrados en las pruebas de terapia genética no deberían tener relaciones financieras personales con las compañías que pudieran beneficiarse de los resultados de estas pruebas.

Varios problemas éticos han surgido alrededor de las terapias celular y genética, primero, la preocupación por las posibles alteraciones genéticas en los humanos, segundo, hay preocupación acerca del potencial para alterar inadvertidamente  (o a propósito) la configuración genética de las células germinales, y su transmisión a generaciones futuras y tercero, la fuente de SC,  más específicamente el uso del tejido humano fetal para aislamiento de SC  y la discusión acerca del aborto y de la experimentación con tejido fetal, controversia que ha generado la mayor controversia y discusión acerca de el estudio con SCE.

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